大肠杆菌化学转化原理

步骤 1）将感受态细胞取出，置于冰上5min化开。 2）注入5-10μL连接产物，混匀，冰浴30min。 3）42℃，60-90s；冰浴2min.37℃，摇床1h。 4）5,000 RPM，1min，吸500μL上清弃掉，之后混匀，涂板。 基本原理 1）DNA要进入细胞需要克服的困难： 困难1：DNA带负电荷，细菌的细胞膜也带负电荷，需要克服DNA和细胞膜间的电荷排斥作用； 困难2：DNA进入细胞需要细胞膜上有孔隙。 2）克服电荷排斥： 化学感受态细胞转化的第一步，加入DNA后，轻弹管壁混匀； 冰上静置，使Ca2+与DNA结合中和DNA的负电荷，Ca2+与细菌细胞膜结合中和电荷，克服外来DNA和细菌细胞膜之间的负电荷排斥作用。Ca2+与DNA和细菌细胞膜脂多糖的磷酸盐形成配位络合物，Ca2+促进了DNA和脂多糖的结合。 3）孔隙的形成与消失： 化学感受态细胞转化的第二步是热激。热激使得温度升高，细胞膜的脂质释放，在细胞上形成孔隙，DNA进入细菌内部。热激后在冰上冷却2min，温度降低，细胞膜的蛋白质释放，脂质占比增高，细胞膜的流动性升高，细胞膜上的孔隙消失。 4）抗性基因的表达 化学感受态细胞转化的第三步，加入LB培养基，37℃复苏，该步骤的主要作用是使感受态细胞恢复生长，使感受态细胞中的质粒表达抗性基因，这样在涂板后带有目标质粒的大肠杆菌在相应抗性的平板上才能正常生长。 综上，化学感受态细胞在转化过程中进行冰上放置是为了使DNA吸附到感受态细胞表面；热激步骤使感受态细胞表面形成孔洞，DNA进入感受态细胞内；冰上孵育使得感受态细胞的孔洞消失；37℃复苏是为了使得细胞恢复生长并表达抗性基因。