琼脂糖凝胶DNA回收

准备事项 ·在BufferDW2中，加入4倍体积的无水乙醇，并于室温保存。 ·小型高速离心机（～12,000×g） ·水浴锅温度设至50～55℃

实验步骤： 1、配制合适浓度的琼脂糖凝胶，电泳分离DNA片段。当DNA片段分离后，把凝胶放置于紫外灯下，快速切下含目的DNA片段的凝胶，并尽量去除多余的凝胶。 2、称取凝胶块的重量，并转移至1.5或2.0ml离心管中。按100mg凝胶块相当100μL体积计算，加入1～3倍体积Buffer GDP。50～55℃水浴10～15分钟，让凝胶块完全溶解。水浴期间，颠倒混匀3次加速溶胶。 若凝胶块重量为200mg，则加入200～600μL Buffer GDP。 凝胶浓度超过2.0％时，加入2～3倍体积的Buffer GDP。 处理超过5KB的片段，加3倍体积（凝胶体积）溶胶后，再加入1倍体积（凝胶体积）异丙醇混匀后再按第三步进行操作。 3、短暂离心收集管壁上的液滴。将 HiPure DNA Mini Column 套在2ml离心管中。把≤700μL溶胶液转移至柱子中。12，000×g离心30～60秒。 4、（可选：溶胶液超过700μL）倒弃滤液，把柱子套回2ml离心管中。把剩余的溶胶液转移至柱子中。12，000×g离心30～60秒。 5、倒弃滤液，把柱子套回2ml离心管中。加入300μL Buffer GDP至柱子中。静置1分钟。12，000×g离心30～60秒。 6、倒弃滤液，把柱子套回2ml离心管中。加入600μL Buffer DW2（已用无水乙醇稀释）至柱子中。12，000×g离心30～60秒。 7、倒弃滤液，把柱子套回2ml离心管中。加入300μL Buffer DW2（已用无水乙醇稀释）至柱子中。12，000×g离心2分钟。 取出柱子时，不要让柱子底部接触到液体，若碰到了液体，倒弃液体后再离心1分钟。对某些敏感应用（需将大部分洗脱液加入连接反应液时）：打开柱子的盖子，空气干燥5分钟以彻底去除乙醇。 8、把柱子套在1.5ml离心管中，加入15～30μL Elution Bufer至柱子膜中央。放置2分钟。12，000×g离心1分钟。丢去柱子，把DNA保存于-20℃。 若需要获得最高产量，建议重复第9步(这里确实是9，俺也不知道这个第9步是哪里来的)进行第二步洗脱。回收大于3KB以上的片段时，最好把Elution Buffer预热至55℃。

改进版实验步骤： 1、配制合适浓度的琼脂糖凝胶，电泳分离DNA片段。当DNA片段分离后，把凝胶放置于紫外灯下，快速切下含目的DNA片段的凝胶，并尽量去除多余的凝胶。 2、称取凝胶块的重量，并转移至1.5或2.0ml离心管中。加入500μL的Buffer GDP。55℃水浴10～15分钟，让凝胶块完全溶解。水浴期间，颠倒混匀3次加速溶胶。 3、短暂离心收集管壁上的液滴。将 HiPure DNA Mini Column 套在2ml离心管中。把500μL溶胶液转移至柱子中。13,000 RPM 瞬离(离心机转速到达13,000 RPM 后即可立即按stop键，实际时间大约0-3秒)。 4、（可选：溶胶液超过700μL）倒弃滤液，把柱子套回2ml离心管中。把剩余的溶胶液转移至柱子中。13,000 RPM 瞬离。(如果需要提高产量，则保留该步骤) 5、倒弃滤液，把柱子套回2ml离心管中。加入300μL Buffer GDP至柱子中。静置1分钟。13,000 RPM 瞬离。 6、倒弃滤液，把柱子套回2ml离心管中。加入600μL Buffer DW2（已用无水乙醇稀释）至柱子中。13,000 RPM 瞬离。 7、倒弃滤液，把柱子套回2ml离心管中。加入300μL Buffer DW2（已用无水乙醇稀释）至柱子中。13,000 RPM 离心2分钟。 取出柱子时，不要让柱子底部接触到液体，若碰到了液体，倒弃液体后再离心1分钟。对某些敏感应用（需将大部分洗脱液加入连接反应液时）：打开柱子的盖子，空气干燥5分钟以彻底去除乙醇。 8、把柱子套在1.5ml离心管中，加入15～30μL ddH2O(双蒸水)至柱子膜中央。于55℃水浴锅中放置2分钟(可延长到5min)。13,000 RPM 离心1分钟(可延长到2min，以提高产量)。丢去柱子，把DNA保存于-20℃。

参考源:

[1]美基生物琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒HiPure Gel Pure DNA Mini Kit (D2111)的说明书