碱裂解法提取质粒

原版实验步骤： All centrifugation should be performed at room temperature unless otherwise noted.For low copy number plasmids refer to Page 6.This protocol is designed to isolate plasmid DNA from E.coli grown in an overnight 1-5 mL LB culture. MateriaIs and Equipment to be Supplied by User: 100% ethanol Isopropanol Microcentrifuge capable of at least 13,000xg Nuclease-free 1.5 mL or 2 mL microcentrifuge tubes Ice bucket Culture tubes Water bath or incubator capable of 42℃ Water bath or incubator capable of 70℃ Optional:sterile deionized water Optional:3M NaOH

Before Starting: Chill N3 Buffer on ice Set heating block or water bath to 42℃ Heat Elution Buffer to 70C if plasmid DNA is>10 kb Prepare DNA Wash Buffer,HBC Buffer,and Solution I according to the instructions in the Preparing Reagents section on Page 4

1. Isolate a single colony from a freshly streaked selective plate, andinoculate a culture of 16 hr at 37℃ with vigorous shaking (~300 rpm).Use a 10-20 mL culture tube or a flask with a volume of at least 4 times the volume of the culture. It is strongly recommended that E.coli be used for routine plasmid isolation. An OD6o reading between 2.0 and 3.0 is an indication that bacterial cells are at an optimal density for harvesting, and plasmid DNA isolation

2. Centrifuge at 10,000xg for 1 minute at room temperature.

3. Decant or aspirate and discard the culture media.

4. Add 250 μL Solution Ⅰ/RNase A. Vortex or pipet up and down to mix thoroughly. Complete resuspension of cell pellet is vital for obtaining good yields.

Note: RNase A must be added to Solution I before use. Please see the instructions in the Preparing Reagents section on Page4.

1. Add 250 μL Solution Ⅱ. Invert and gently rotate the tube several times to obtain a clear lysate.A 2-3 minute incubation may be necessary.

Note:Avoid vigorous mixing as this will shear chromosomal DNA and lower plasmid purity. Do not allow the lysis reaction to proceed more than 5 minutes. Store Solution Ⅱ tightly capped when not in use to avoid acidification from CO2 in the air.

1. Add 125 μL ice cold N3 Buffer. Gently invert several times until a flocculent white precipitate forms.

Note: The Buffers must be mixed throughly. If the mixture appears still viscous,brownish and conglobated, more mixing is required to completely neutralize the solution.Complete neutralization of the solution is vital of obtaining good yields.

1. Centrifuge at maximum speed (≥13,000x g) for 10 minutes.A compact white pellet will form.Promptly proceed to the next step.

2. Transfer the cleared lysate to a new 1.5 mL microcentrifuge tube. Measure the volume of the cleared lysate transferred.

3. Add 0.1 volume ETR Solution. Invert the tube 10 times to mix thoroughly. Note: If you transferred 500 μL cleared lysate,ten add 50 μL ETR Solution.

4. Incubate on ice for 10 minutes.Invert the tube serval times during the incubation.

Note: After addition of ETR Solution,the lysate should appear turbid, but it should become clear after incubation on ice.

1. Incubate the lysate at 42℃ for 5 minutes. The lysate should appear turbid again.

2. Centrifuge at 12,000xg for 3 minutes at 25C. The ETR Solution wil form blue layer at bottom of tube.

3. Transfer the top aqueous phase (cleared lysate) to a new 1.5 ml tube, add 0.5 volume room temperature for 1-2 minutes.

4. Insert a HiBind®DNA Mini Column into a 2 mL Collection Tube. Optional Protocol for Column Equilibration:

   1. Add 100 μL 3M NaOH to the HiBind®DNA Mini Column.

   2. Centrifuge at maximum speed for 30-60 seconds.

   3. Discard the filtrate and reuse the collection tube.

5. Transfer 700 μL mixture from Step 13 into the HiBind®DNA Mini Column.

6. Centrifuge at maximum speed for 1 minute.

7. Discard the filtrate and reuse the collection tube.

8. Repeat Steps 15-17 until all of the mixture has been transferred to the column.

9. Add 500 μL HBC Buffer.

Note:HBC Buffer must be diluted with isopropanol before use. Please see Page 4 for instructions.

1. Centrifuge at maximum speed for 1 minute.

2. Discard the filtrate and reuse collection tube.

3. Add 700 μL DNA Wash Buffer.

Note: DNA Wash Buffer must be diluted with 100% ethanol prior to use. Please see Page 4 for instructions.

1. Centrifuge at maximum speed for 1 minute.

2. Discard the filtrate and reuse the collection tube.

3. Repeat Steps 22-24 for a second DNA Wash Buffer wash step.

4. Centrifuge the empty HiBind®DNA Mini Column for 2 minutes at maximum speed to dry the column matrix.

Note:It is important to dry the HiBind® DNA Mini Column matrix before elution. Residual ethanol may interfere with downstream applications.

1. Transfer the HiBind® DNA Mini Column to a clean 1.5 mL microcentrifuge tube.

2. Add 30-100 μLEndo-Free Elution Buffer or sterile deionized water directly to the center of thecolumn membrane.

Note:The efficiency of eluting DNA from the HiBind® DNA Mini Column is dependent on pH. If using sterile deionized water, make sure that the pH is around 8.5.

1. Let sit at room temperature for 1 minute.

2. Centrifuge at maximum speed for 1 minute.

Note:This represents approximately 70% of bound DNA. An optional second elution will yield any residual DNA,though at a lower concentration.

1. Store DNA at-20℃.

改进版实验步骤： 除非另有说明，所有离心均应在室温下进行。低拷贝数质粒请参阅第 6 页。本方案用于从 1-5 mL LB 培养液中培养过夜的大肠杆菌中分离质粒 DNA。 使用者需提供的材料和设备： 100% 乙醇 异丙醇 转速可达 13,000 RPM 的微型离心机 不含核酸酶的 1.5 mL 或 2 mL 微型离心管 冰桶 培养管 42℃水浴或培养箱 70℃ 水浴或培养箱 可选：无菌去离子水 可选：3M NaOH 在开始之前 冰镇 N3 缓冲液 将加热块或水浴设置到 42℃ 如果质粒 DNA 大于 10 kb，将洗脱缓冲液加热至 70℃ 按照第 4 页试剂制备部分的说明制备 DNA 冲洗缓冲液、HBC 缓冲液和溶液 I

1. 从新鲜划线的选择性平板中分离出单菌落，并在剧烈振荡（~300 rpm）下接种 37℃ 16 小时的培养物。使用 10-20 mL 培养管或容量至少为 4 倍培养体积的烧瓶。强烈建议使用大肠杆菌进行常规质粒分离。 OD60 读数在 2.0 和 3.0 之间表明细菌细胞处于收获和质粒 DNA 分离的最佳密度

2. 室温下以 4,000 RPM 离心8-10分钟。

3. 倾析或吸出培养基并丢弃，弃上清时需要打开水龙头，使得倾倒出的培养基被冲走。然后将培养管倒置到吸水纸(擦手纸)上约2min，尽可能使得管内没有培养基的液体残留。

4. 添加 400 μL SolutionⅠ/RNase A。涡旋或上下吹打以充分混合。然后将混合均匀的溶液转到新的 1.5mL EP管中。细胞沉淀的完全重悬对于获得良好的产量至关重要。

注意：使用前必须将 RNase A 添加到 Solution Ⅰ 中。

1. 添加 400 μL SolutionⅡ。翻转并轻轻旋转管数次以获得澄清的裂解物。可能需要孵育 2-3 分钟。

注意：避免剧烈混合，因为这会剪切染色体 DNA 并降低质粒纯度。不要让裂解反应进行超过 5 分钟。 Solution Ⅱ不使用时应盖紧盖子，以免被空气中的CO2酸化。

1. 添加 200 μL 冰冷的 N3 缓冲液。轻轻翻转几次，直至形成絮状白色沉淀。然后使用振荡器使得沉淀在溶液中分布均匀。

注意：缓冲液必须充分混合。如果混合物看起来仍然粘稠、呈棕色且呈球状，则需要更多的混合以完全中和溶液。溶液的完全中和对于获得良好的产率至关重要。

1. 以最大速度（≥13,000 RPM）离心10分钟。将形成致密的白色沉淀。立即进行下一步。

2. 将澄清的裂解液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。原则上是应吸尽吸，沉淀为固体物质，不太容易被吸起来。测量转移的澄清裂解液的体积 体积大约是 1 mL。

3. 添加 0.1 体积(按照以上步骤操作的话此处为100μL)的 ETR 溶液。翻转管 10 次以充分混合。注意：如果转移 500 μL 澄清裂解液，则添加 50 μL ETR 溶液。在吸取ETR溶液前需剪枪头。ETR 溶液为该厂商特有的内毒素去除液。

4. 在冰上孵育 10 分钟。在孵育过程中翻转管数次。建议在等待孵育的时间里，将水浴锅打开并设置为42℃；执行第14步中激活柱子的可选方法1、2、3；回收从4℃冰箱拿出的试剂。

注意：加入 ETR Solution 后，裂解液应出现混浊，但在冰上孵育后应变得澄清。

1. 裂解液42℃孵育5分钟。裂解物应再次出现混浊。

2. 25℃、13,000 RPM 离心 3 分钟。 ETR 溶液将在管底部形成蓝色层。

3. 将顶部水相（澄清的裂解液，大约是1 mL）转移至新的 2 ml 管中，加入 0.5 倍体积，即 500μL 的无水乙醇，轻柔地翻转试管6-7次后，室温放置 1-2 分钟。

4. 将 HiBind®DNA Mini Column 插入 2 mL 收集管中。 柱平衡的可选方案：

   1. 将 100 μL 3M NaOH 添加到 HiBind®DNA Mini Column 中，添加速度要快，防止NaOH被酸化。

   2. 以13,000 RPM 离心 30-60 秒。

   3. 倒掉滤液并重新使用收集管。

5. 将步骤 13 中的 750 μL 混合物转移至 HiBind®DNA Mini Column 中。

6. 以13,000 RPM 瞬离。

7. 丢弃滤液并重新使用收集管。

8. 重复步骤 15-17，直到所有混合物都转移到柱中。

9. 添加 500 μL HBC 缓冲液。

注意：HBC Buffer 使用前必须用异丙醇稀释。请参阅第 4 页了解说明。

1. 以13,000 RPM 瞬离。

2. 丢弃滤液并重新使用收集管。

3. 添加 700 μL DNA 洗涤缓冲液。

注意：DNA 洗涤缓冲液在使用前必须用 100% 乙醇稀释。请参阅第 4 页了解说明。

1. 以13,000 RPM 瞬离。

2. 丢弃滤液并重新使用收集管。

3. 重复步骤 22-24 进行第二次 DNA 洗涤缓冲液洗涤步骤。

4. 将空的 HiBind®DNA Mini Column 以 13,000 RPM 离心 2 分钟以干燥柱基质。

注意：洗脱前干燥 HiBind® DNA Mini Column 基质非常重要。残留的乙醇可能会干扰下游应用。

1. 将 HiBind® DNA Mini Column 转移至干净的 1.5 mL 微量离心管中。在打开盖子的情况下在60℃烘箱中烘 5min ，同时将装有Endo-Free Elution Buffer的瓶子闭盖放入60℃烘箱中烘 5min。

2. 将 130 μL Endo-Free Elution Buffer 或无菌去离子水直接添加到柱膜中心。(一定要记得换枪头)

注意：从 HiBind® DNA Mini Column 洗脱 DNA 的效率取决于 pH 值。如果使用无菌去离子水，请确保 pH 值在 8.5 左右。

1. 在60℃烘箱内全部闭盖静置 5 分钟。

2. 以13,000 RPM 离心 2 分钟。

注意：这代表大约 70% 的结合 DNA。可选的第二次洗脱将产生任何残留的 DNA，但浓度较低。

1. -20℃保存DNA。

2. 对质粒DNA进行定量。上本底(ddH2O)四个以及样品各2 μL。

3. 整理仪器。

参考源:

[1]E.Z.N.A.Endo-Free Plasmid DNA Mini Kit I Protocol-Spin Protocol的说明书